近年来，免疫组学研究一直备受关注，10x Genomics也为全球的科学家们提供了完整的免疫组学解决方案。而今年，病毒感染的免疫机制更是大家关注的热点。今天，小编将为大家解读一篇2020年初发表在《Immunity》上的文献，希望作者的研究能对您有所启发。
文献名称：Immune Landscape of Viral- and Carcinogen-Driven Head and Neck Cancer
发表期刊：Immunity
发表时间：2020年1月
影响因子：21.522
头颈鳞癌（HNSCC）主要是由环境致癌物以及人乳头状病毒（HPV）引发的肿瘤疾病。这篇文章主要通过10x的单细胞转录组技术结合组织切片多色免疫荧光标记技术对HPV-（环境致癌）和HPV+（病毒致癌）的患者的免疫细胞进行综合分析研究。通过单细胞转录组结果得到不同样本间免疫细胞谱系的差异及分化轨迹，同时通过组织切片的多色免疫荧光分析技术对转录组数据进行验证分析，同时结合空间位置信息得到了HNSCC的免疫细胞的景观图谱。这项研究有助于了解致癌物诱发和病毒诱发癌症患者的泛免疫图景，为今后深入探索免疫细胞在HNSCC和其他肿瘤类型中的作用提供基础框架、参考数据集和必要资源。
图1. 图文摘要
实验组：选取了18个HPV-的HNSCC患者，8个HPV+的HNSCC患者的全血样本和肿瘤组织样本；对照组：选取5个有呼吸中止症但没有患癌的患者的扁桃体组织和6个健康人的全血样本作为对照组。PBMC细胞：用密度梯度离心的方法从全血中进行分离，400g 20min；用汉克斯缓冲盐水进行清洗；用PBS+0.1%叠氮化合物+10mM HEPES+2%FBS进行细胞重悬得到单细胞悬液。肿瘤或者扁桃体组织：机械剪碎；在RPMI中用50ug/ul的胶原酶37℃ 15min进行解离；用100um的细胞筛进行过滤；500g 10min离心重悬，裂红后得到单细胞悬液。处理后的细胞悬液通过流式分选得到CD45+的细胞，在通过10x Genomis进行单细胞的捕获以及3’转录组的分析；组织切片处理：对石蜡包埋好的切片，用二甲苯和酒精脱蜡；用中性的福尔马林试剂固定15分钟；在AR6或AR9柠檬酸缓冲液中重复循环进行热诱导表位修复；封闭10min后进行一抗的30min孵育；经过洗涤后加入带有辣根过氧化物酶的二抗孵育10min；添加不同的opal荧光：CD4::Opal540,CD8::Opal570, CD20::Opal520,CD68::Opal650, FOXP3::Opal620, 和Pan-cytokeratin::Opal690分别用全自动定量病理成像系统Vectra (Perkin Elmer)对切片上的不同细胞类型进行多色荧光检测，每张切片选取2-5个ROIs，一共选取了90个ROIs进行分析。⑴对所有样本来源的免疫细胞谱系进行单细胞转录组研究，同时对比了HPV+和HPV-样本中免疫细胞在基因表达上的差异，确定了差异最大的四个谱系分别为CD4+T细胞，B细胞，细胞毒性T细胞（CD8+T细胞和NK细胞）和骨髓细胞。
图2. 对所有样本进行单细胞转录组分析
⑵对CD8+T细胞的细胞分化轨迹进行研究，找到了HPV+患者和HPV-患者之间共享的分化轨迹，这表明针对CD8+T细胞的免疫治疗策略可能共同适用于病毒和致癌物诱导的HNSCC。
图3. HPV+和HPV-中CD8+ T细胞相似的细胞分化轨迹
⑶对CD4+Tconv细胞和CD4+Treg细胞的异质性和分化轨迹进行研究。发现CD4+Tconv细胞在PBMC样本和组织样本中有很大的异质性，并且发现了CD4+Tconv细胞在HPV+和HPV-HNSCC患者各自独特的分化轨迹。而CD4+Treg细胞在HPV+和HPV-HNSCC患者中的分化轨迹类似。
图4. CD4+ Tconv细胞和CD4+ Treg细胞的异质性和分化轨迹的研究
⑷作者分析了HPV+和HPV-HNSCC患者中的B细胞，得出结论:HPV+患者中的生发中心B细胞通过生发中心反应存在于不同的发展阶段，而在HPV-患者中确很少有发现。
图5. 对样本中的B细胞的分析
⑸对PBMC样本和组织样本中的骨髓细胞的细胞分化轨迹进行分析，找到了PBMC样本和组织样本之间的一个关键细胞亚群cluster5在PBMC和组织样本中共同存在起到枢纽的作用。
图6. 骨髓细胞的分化轨迹研究
⑹通过多光谱免疫荧光对组织切片的细胞进行空间邻近性分析，并对单细胞转录组的结果进行一致性验证。这些分析确定了与CD4+T卵泡辅助细胞相关的基因表达特征，该特征与HNSCC患者较长无进展生存期相关。这些数据集和分析方法为进一步研究免疫细胞对病毒和致癌物引起的癌症的影响提供了资源。
来源： 仁科生物
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