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单细胞转录组（多标签）

产品介绍

       单细胞多标签测序采用多标签标记单个细胞、pooling后构建文库的方法，能够同时处理上百个单细胞，精准挖掘批量单细胞样品间基因表达的差异，进行细胞分群，该方法大幅提高了测序通量、降低了成本，广泛适用于存在高度异质性的肿瘤细胞、早期胚胎发育的细胞群体、干细胞分化等系统。

技术流程

部分结果展示

分析结果主要包括：数据质控、参考基因组比对、基因表达分析、主成分分析（PCA）、tSNE、聚类、GO和KEGG分析、最小生成树等。



多标签介绍图0（测序数据质量汇总）.png

测序数据质量汇总





                                                                                 nGene                                      nUMI

多标签介绍图1（nGene nUMI 测序质量图）.png

测序质量图








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参考基因组序列比对






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          基因表达分析






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       主成份分析






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tSNE1分析图





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标记基因在不同细胞群的表达





多标签介绍图7.png

最小生成树





多标签介绍图8（聚类分析）.png

聚类分析





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GO和KEGG分析


送样要求

一、
从组织分离单细胞，要求是新鲜的组织，没有经过冷冻、固定等处理。
二、
保证细胞活性和形态完整，不要损伤细胞。
三、
分离的单细胞放入公司提供的裂解液中，使用干净的无核酸酶的96孔板或200µl的八连排PCR管,每管/每孔裂解液用量为2.55µl，放入细胞时带入缓冲液体积不要超过0.5µl。
四、
细胞数量：每管/每孔放入一个细胞，每种细胞建议至少取5个细胞做重复。【细胞分群，每种类型细胞至少5个，要看最关心的细胞类型所占比例，比如目标细胞占比5%的话就需要测100个细胞。】
五、
单细胞放入裂解液后，-80℃保存，干冰运输。运输的时候要将管子做好包装，放入干冰中，以防运输过程中管子损坏。
六、
裂解液-80℃保存，避免反复冻融。
七、
操作过程尽量保持低温环境，加入单细胞的裂解液尽快放入-80℃保存，最好不要 超过1小时，中间的时间越短越好。
八、
样本一旦放在-80℃或干冰冻存之后，不能反复化冻。

常见问题

单细胞mRNA测序（多标签）， 1个细胞多少reads？测序深度？

每个细胞测序数据量是1.5 million pair-end reads，一般最终质控之后比对上的reads在1 million，相对细胞内mRNA总量已经足够饱和了。满足精准度要求。

多标签方法的单细胞转录组测序，用96孔板，人工操作的话，孔与孔之间的差异有多大？是否有统计分析过操作误差？

这种方法采用了绝对的定量分析，样本质量稳定的话，比普通方法的bench effect小很多。我们有比较过不同批次做的同种细胞，从聚类上来讲是分不开的。

多标签方法的单细胞转录组测序，每次送样的样本数量有要求吗？

有要求，一次送样样本数量最低不能少于40个。

单细胞mRNA测序， 极客基因有三种方法，主要的区别是什么？

1、基于Smart-seq2的全长mRNA测序， 测序序列比对后能覆盖mRNA全长，不但能够分析基因表达，还能深入分析可变剪切、基因突变等信息。通量低、成本高，适用于样品数量不多的情况。Smart-seq2主要实验步骤：单细胞裂解释放RNA——反转录——扩增——纯化——质检——DNA片段化——构建测序文库——测序——生信分析；

2、极客基因高通量Multiplexed（多标签）单细胞转录组测序， 能够同时处理上百个细胞，研究批量单细胞样品间的基因表达差异，进行细胞分群。通量提高、成本降低。非全长mRNA，不能看可变剪切等信息。主要实验步骤：单细胞裂解释放RNA——反转录——扩增——pooling、纯化——质检——DNA片段化——构建测序文库——测序——生信分析；

3、10X单细胞转录组测序， 同时测一个组织中上万个细胞的mRNA，分析基因差异表达、细胞分群。检测到的基因数量较其它方法少。通量高，成本低。